三代测序

PacBio第三代测序技术引领基因测序新篇章

以美国Pacific Biosciences公司为代表的最新的第三代测序技术,相比第二代高通量测序技术,采用了更为先进的SMRT(Single molecule real-time)单分子实时测序技术,从而避开了第二代测序技术中依赖于PCR扩增起始DNA片段的步骤(用于放大碱基荧光信号)。PacBio专利的SMRT技术的诞生赋予了第三代测序技术全面的优势:

1. 不依赖于PCR扩增富集待测DNA片段:真正实现了对起始DNA分子的测定,避免了PCR扩增过程中出现的偏差、错误和嵌合体;

2. 测序读长轻松达到10 kb甚至更长:相比第二代测序技术取得质的飞跃,极大地提升了物种鉴定的精度和灵敏度,大幅度改进了全基因组序列图谱的拼接组装和绘制能力;

3. 独有的CCS环形一致性测序模式(Circular-consensus sequence):不存在系统性的检测偏差,碱基读取错误分布随机,因而能够对每个待测DNA分子进行循环测序,从而获得准确率极高的一致性序列(多次循环后的一致性准确率可达99.999%以上),也有利于进行单倍体型鉴定、基因组罕见突变和SNP单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism)等验证;

4. DNA聚合酶系统强大:对于A/T和G/C碱基的检测无偏好性,可均匀覆盖全基因组,轻松测定高GC含量和Poly-A序列区域等第二代测序技术难以解决的技术瓶颈;

5. 能够直接原位检测碱基修饰:如DNA甲基化检测等。

PacBio三代测序的全面优势:超长读长、超高的碱基一致性准确率、无碱基偏好性、实时直接识别碱基修饰

测序原理

通过PacBio独有的零模波导孔(Zero-Mode Waveguides,ZMWs),可以将DNA分子链锚定在ZMWs孔底部,通过DNA聚合酶的作用,使带有荧光标记的dNTP与DNA模板链结合,并在激光照射下发出荧光信号,如此实现单分子级别的的实时测序和荧光信号捕捉。

目前Pacific Biosciences公司已先后推出了RS II和Sequel两款基于SMRT技术的第三代测序系统。相比RS II而言,最新的Sequel测序系统进行了全方位的优化和改进,不仅大幅减小了仪器的体积,测序的效率和通量也有了极大的提升,每一个SMRT Cell的测序通量整整提升了7倍,最大数据产出量(共包含16个SMRT Cell,每个Cell每次运行最多能获得3.5~7 Gb的碱基数据量)已达到或超过大部分第二代测序技术。

参数

RS II

Sequel

平均读长

~20 Kb

8 ~ 12 Kb

ZMW

150 K

1 M

Reads数/SMRT cell

~55 K

~350 K

通量/SMRT cell

0.5 ~ 1 Gb

3.5 ~ 7 Gb

SMRT cell

1 ~ 16

PacBio两款测序设备(RS II和Sequel)的参数比较。