第三代高通量测序平台

PacBio RS IIPacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统(Single Molecule Real Time, SMRT),其专利的SMRT Cell含有15,000个纳米级的零模波导孔(zero-mode waveguides, ZMWs),每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序,并实时检测插入碱基的荧光信号。

技术特点

超长读长:最长可达到40kb,提高拼接准确率和完整性;测序时间短:从DNA到数据只需10个小时;准确率高:对基因组组装和基因组变异检测,可以最多达到99.999%的准确率;敏感性强:可以检测频率在0.1%的minor variants;DNA起始量较低,最低只需要250ng;无PCR扩增偏好性:样本不需要进行PCR扩增,避免了覆盖度不均一和PCR artifacts;最小的GC偏好性(GC bias):在极端高GC和极端低GC区域,可以轻松测定,从而保证序列的均匀覆盖度。

数据产出

试剂盒

平均读长

数据量/SMRT Cell

P6-C4 Chemistry

10Kb-14Kb

500Mb-1Gb

P5-C3 Chemistry

8-10Kb

~250Mb

P4-C2 Chemistry

5.5-6Kb

~200Mb

 

 
 

 

应用领域

1)全基因组de novo测序

与二代测序最高不超过1Kb的读长相比,PacBio RS II的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题。同时,与二代测序的模板样品需要扩增相比,PacBio RS II无需扩增可直接对单个分子进行测序,有效避免了PCR扩增偏好性和GC偏好性,PacBio RS II可轻松跨越GC含量异常(过高或过低)及高度序列重复的区域,实现序列覆盖的完整性和均一性

2)基因组草图的优化或基因组完成图绘制

对前期已开展测序的动植物、微生物等基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升。针对前期已经开展全基因组测序,获得基因组草图的动植物、微生物等,可以结合PacBio RS II平台长读长reads进行补充,从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度。另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息(structural-variation events)、串联重复序列信息(tandem duplication)、易位信息(Inversion)等。尤其在微生物基因组完成图的绘制中,可在一天之内、成本低于$1,000即可将基因组完善获得0 gap contig

3)全长转录本测序

PacBio RS II的长读长可实现全长转录本测序,并使基因可变剪接形式的识别成为可能,因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究。同时,长读长不再需要对RNA-Seqreads进行组装,因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释,用以改进参考基因组中的基因注释信息。

4)宏基因组测序

长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定,能够更加快捷地获得更多微生物物种的全基因组序列。

516S rDNA全长测序

PacBio RS II的平均读长为8-10Kb,而16S rDNA长度大约为1540bp,因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列。

6)细胞器基因组测序

叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构,PacBio RS II的长读长可直接跨越这些区域获得这些细胞器的全基因组序列信息等,基因组组装不依赖于是否有近缘物种的线粒体和叶绿体基因组信息等、重测序能够检测到全面的SNPsindel信息。

7)全基因组重测序&稀有变异鉴定

PacBio RS II长读长测序readsGC偏好,能够全面获得基因组的遗传变异,包括SNPs的鉴定到CNVSV结构变异等,可运用至人类癌症基因组重测序等。PacBio RS II平台10 小时即可完成测序,可应用至需要快速反馈的临床检测中,如细菌感染疾病中细菌的鉴定、病毒的鉴定等,取样开展重测序和目前已有的细菌、病毒基因组数据库进行比对鉴定即可。

8)表观遗传学

PacBio RS II利用测序过程聚合酶反应的动力学变化,首次实现对碱基修饰进行直接测序。当碱基有额外修饰时,DNA聚合酶的合成速度会减慢,对应的信号会被检测出来。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的停顿模式”PacBio RS II产生微小差异,最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。除了甲基化修饰,还可以检测5-hC5-hmU5-hU1-mA6-mA8-oxoABPDE6-mT6-mG等碱基修饰,甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰。PacBio平台可以在测序的同时即可检测表观遗传学修饰信息,只需对测序数据选择合适的软件即可分析碱基修饰信息。