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16S+功能基因+qPCR,共话厌氧氨氧化细菌之特性

2019-06-07


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正 文



近期,派森诺生物与中国海洋大学合作,在《Systematic and Applied Microbiology》(最新影响因子3.899)发表研究论文,通过qPCR和高通量测序实验揭示厌氧氨氧化细菌在长江口及其邻近海域沉积物中的群落结构和分布特性,为微生物参与氮循环研究提供了新视角。

 


研究背景‍



大多数人为产生的氮通过河流、地下水和大气活动被输送至河口和沿海地区。了解氮的去除以及相关微生物参与氮循环的过程对生态系统的保护至关重要。厌氧氨氧化细菌对海水中氮的去除有着重要影响,而Amx-16S rRNA和hzo基因可作为研究厌氧氨氧化细菌在自然生态系统中群落特征的标志基因。


长江口是长江三角洲前缘的一个大河段,接受长江陆源物质的大量输入。这条河流对长江口及其邻近海域的理化性质、环境和生态系统有着很大的影响。对该区域氮循环微生物的研究对生态系统的保护有着重要意义。

 


研究目的



通过qPCR和高通量测序了解长江口海域厌氧氨氧化细菌的分布和群落结构;

 


测序方法



测序技术:Roche 454高通量测序平台


测序模式:厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因+功能基因hzo测序


实验对象:沉积物



实验设计



自2011年7月至8月,从长江口及其邻近的东海域收集20份表层沉积物和地层水样本。沉积物样本用于分子生物学分析,底层水用于理化性质分析。厌氧氨氧化细菌amx-16S rRNA基因和hzo功能基因用于厌氧氨氧化细菌qPCR和高通量测序分析,反硝化细菌功能基因nirS用于反硝化细菌的qPCR分析。


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图1 长江口及其邻近海域取样点分布图

 


研究结果


不同取样点厌氧氨氧化细菌的丰度和多样性组成谱



▶ 厌氧氨氧化细菌丰度


amx-16S rRNA基因在不同取样点的拷贝数从6.73×105到3.81×107 g−1(鲜重)不等,在取样点S33拷贝数最多,S22拷贝数最少;厌氧氨氧化细菌功能基因hzo在不同取样点的拷贝数从9.86×106到1.02×10g−1(鲜重)不等,在S33拷贝数最多,S1拷贝数最少,表明厌氧氨氧化细菌的丰度在长江口及其邻近海域有着空间差异。厌氧氨氧化细菌在长江口的丰度低于浙江南部沿海地区(图2a,b)。


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图2 不同取样点amx-16S rRNA(a)、hzo(b)、nirS(c)的丰度以及反硝化和厌氧氨氧化的比值(d)

 

▶ 海洋沉积物中厌氧氨氧化细菌的多样性和丰富度


amx-16S rRNA基因、功能基因hzo 的高通量测序研究结果表明不同取样点的厌氧氨氧化细菌多样性有着空间上的差异,并且由amx-16S rRNA基因表征的厌氧氨氧化细菌在不同取样点的多样性大小与功能基因hzo 表征的结果有所差别(表1)。

 

表1 厌氧氨氧化细菌多样性特征


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系统发育树分析表明3种已知的厌氧氨氧化菌属Ca.ScalinduaCa.Brocadia、Ca. Aestuarianus和某些未知的厌氧氨氧化细菌存在于长江口及邻近海域(图3)。


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图3 基于amx-16S rRNA序列的系统发育树

 

在纲水平,Planctomycetacia 是各取样点(S13、S20、S31、S33)的优势物种(>90%),其余物种为MD2896-B258、Pla3 lineage、Pla4 lineage和Alphaproteobacteria(图4a)。


在属水平,Planctomycetales 分类下的菌属Ca.Scalindua Ca.Brocadia 共同存在于不同的取样点,其中Ca.Scalindua为优势属(约90%),其余菌属uncultured Planctomycetales bacteria、Oceanicella uncultured bacterium、W4 uncultured bacterium和Ca.Brocadia丰度均较低(图4b)。


Ca.Scalindua属下的种水平物种中不可培养的厌氧氨氧化细菌占较大比例,而被检测到的已知物种为anaerobic ammonium-oxidizing planctomycete JMK-2、Ca.Scalindua brodae、Ca.Scalindua sp. enrichment culture clone15L 和 Ca.Scalindua wagneri。其中anaerobic ammonium-oxidizing planctomycete JMK-2 在S20占比较高,而Ca.Scalindua sp. enrichment culture clone 15L在S31占比较高(图5)。


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图4 amx-16S rRNA基因表征的厌氧氨氧化细菌群落结构

 

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图5 amx-16S rRNA基因表征的厌氧氨氧化细菌Scalindua种水平的群落结构

 

NMDS分析表明厌氧氨氧化细菌有着特定的地理分布,其中S20和S30有着相似的群落结构,而其他取样点群落结构差别较大(图6)。


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图6 amx-16S rRNA基因表征的厌氧氨氧化细菌NMDS分析

 

功能基因hzo 高通量测序结果显示所有序列均属于不可培养的菌属,因此对hzo 基因序列构建传统的系统发育树,结果表明在各取样点由hzo 基因表征的优势菌属为Ca. Scalindua(图7)。


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图7 基于hzo 序列的系统发育树



不同取样点反硝化细菌的分布



反硝化细菌功能基因nirS在不同取样点的拷贝数从3.35×107到2.89×109 g−1(鲜重)不等,其中在S32拷贝数最多,S4拷贝数最少。这些结果表明反硝化细菌的丰度在长江口及其邻近海域有着空间差异。反硝化细菌在长江口和浙江南部沿海地区的丰度高于较低的沿海区域(图2c)。反硝化细菌的丰度显著高于厌氧氨氧化细菌(Student’s t test, P < 0.01)。反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌的比值在长江口北部高于南部近海区域(图2d)。此外厌氧氨氧化细菌和反硝化细菌的丰度呈正相关(P<0.05,r=0.447)。

 


厌氧氨氧化细菌丰度和群落结构与环境变量的关系



斯皮尔曼相关性分析显示由amx-16S rRNA基因表征的厌氧氨氧化细菌丰度与沉积物中的TOC(P<0.01,r=0.718)和TN(P<0.01,r=0.811)呈正相关,与底层水的NO3(P < 0.05,r = −0.464)、NOx(P < 0.05,r = −0.472)和PO43−(P < 0.05, r = −0.506)的浓度呈负相关;


此外由功能基因hzo 表征的厌氧氨氧化细菌丰度与沉积物中的TOC(P<0.01,r=0.699)和TN(P<0.01,r=0.747)呈正相关,与底层水的NO3(P < 0.05,r = −0.660)、NOx(P < 0.05,r = −0.659)和PO43−(P < 0.05, r = −0.669)的浓度呈负相关(表2)。

 

表2 环境因子和厌氧氨氧化细菌丰度的斯皮尔曼相关性分析


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RDA分析揭示了厌氧氨氧化细菌丰度和群落结构与环境因子的潜在关系(图8和9)。沉积物环境因子包括深度、盐度、溶解无机氮(DIN)、TOC以及NO2NO3NH4+PO43−浓度对厌氧氨氧化细菌的群落结构以及细菌与生境的关系有着不同的贡献。RDA的前两轴分别解释沉积物厌氧氨氧化细菌70.5%和2.9%的丰度差异(图8)。


此外基于amx-16S rRNA基因高通量测序的RDA前两轴分别解释了72.8%和23.1%的群落结构差异,基于功能基因hzo高通量测序的RDA前两轴分别解释了60.7%个30.3%的群落结构差异(图9)。


这些结果证明了TOC(F=15.21,P<0.01,499 permutations)与氨氧化细菌的丰度有着显著的关系,为RDA分析提供了46%的解释度。


类似地,NO2浓度对群落结构的影响为RDA分析提供了57%的解释度。此外厌氧氨氧化细菌的丰度和组成与深度、盐度、NH4+DIN PO43−浓度有关。


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图8 沉积物厌氧氨氧化细菌丰度和环境因子的RDA分析

 

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图9 沉积物厌氧氨氧化细菌OUT组成和环境因子的RDA分析



总 结



本文通过qPCR和高通量测序技术为厌氧氨氧化细菌在长江口及其邻近海域沉积物中的存在、分布和多样性研究提供了证据。16S rRNA基因和hzo 基因的高通量测序表明Ca. Scalindua Ca. Brocadia 存在于所研究区域的沉积物中。


qPCR结果表明反硝化细菌比厌氧氨氧化细菌的丰度更高。相关性分析和RDA分析结果表明沉积物的理化性质对厌氧氨氧化细菌的群落结构有重要影响。


本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。



文章索引



Lulu Fu et al. Shifts in the anammox bacterial community structure and abundance in sediments from the Changjiang Estuary and its adjacent area. Systematic and Applied Microbiology 34(2019):383-396