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又见短链脂肪酸!结肠菌群如何发酵、利用木聚糖?

2019-05-31

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文案 微生物组产品线


正文


最近,派森诺生物与福建省农业科学院合作,在《International Journal of Biological Macromolecules》(最新影响因子3.909)再次发表论文,以人类结肠微生物菌群为实验对象,制作体外发酵装置,研究了O-乙酰阿拉伯木聚糖对肠道环境的影响,并利用高通量测序技术,探究了在发酵过程中肠道微生物群落的变化。


研究背景


人体肠道是一个庞大、多样且动态变化的微生物栖息地,从饮食中摄取某些特定碳水化合物(如益生元),能有效调节人体肠道菌群。这些碳水化合物在肠道中经肠道菌群发酵产生短链脂肪酸(SCFAs),可降低pH,维护有益的肠道环境,不过,不同碳水化合物在肠道中的发酵部位不同,比如,线性和水溶性的低聚糖或多糖会在结肠近端发酵,但结构更复杂些的多糖便会在结肠远端发酵,且速度缓慢。


然而,由于蛋白质降解过程中产生的氨、聚氨酯和其它不良代谢物的积累,结肠远端其实是较易患癌的部位。结构复杂的多糖可作为结肠远端SCFAs产生的碳源,并抑制蛋白质和脂肪的代谢,减少结肠的患癌风险,因此,若发现可在结肠远端发酵的新多糖,则能极大促进结肠疾病的预防。


不同多糖对人体结肠菌群的影响不同,比如阿拉伯木聚糖能够刺激双歧杆菌的增殖,但目前关于乙酰化木聚糖对人类菌群的影响还知之甚少。本研究中,作者便利用体外培养发酵技术与高通量测序技术,研究了玉米穗轴木聚糖(CCX)和从竹子碎屑中获得的具有免疫刺激活性的O-乙酰阿拉伯木聚糖(BSH-1),对结肠菌群构成的发酵环境的影响,以探究BSH-1对人结肠菌群的影响,为结肠疾病的预防提供理论基础。

 

研究内容


①研究分别添加了BSH-1和CCX的发酵系统与未添加任何碳源的发酵系统中,总碳水化合物、游离单糖、低聚糖、pH、SCFAs和酶活性的变化;


②研究BSH-1和CCX对结肠微生物群落的影响。

 

研究目的


研究BSH-1对人结肠环境与微生物群落的影响,为结肠疾病的预防提供理论基础。

 

材料与方法


测序技术:Illumina MiSeq高通量测序平台

测序模式:微生物组细菌16S rRNA基因V4区测序

实验对象:发酵底物‍


实验设计


接种新鲜人粪便,设置BSH-1与玉米穗轴木聚糖(CCX)的体外发酵器,将发酵器置于37℃的厌氧环境下发酵,每隔6 h取一次样本,一部分样本用于测定总碳水化合物、游离单糖、低聚糖、pH、SCFAs和酶活性,一部分样本用于微生物组成谱测序。


表1 取样信息


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结 果


体外发酵器中的pH值和碳水化合物变化


发酵过程中,每组样本的pH值和碳水化合物变化分别如图1a、1b所示,在整个发酵过程中,BSH-1组的pH值要低于BLK组,但高于CCX组,即BSH-1或CCX的添加会显著影响肠道环境中的pH值。如图1b所示,发酵24 h(48 h)后,人体结肠细菌对BSH-1和CCX的消耗率分别为33.1%(46.1%)和57.2%(73.5%),即人结肠细菌对BSH-1的消耗率相对于CCX来说较低,这可能是由于CCX的分子量与饱和度更低。


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图1 (a)每组样本中pH值的变化;(b)发酵过程中,各组中总碳水化合物的变化



体外发酵过程中酶活性的变化



通过检测发酵系统中乙酰基、阿拉伯糖和木糖的去除率,本研究分析了AcXEs、阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶的酶活性变化。如图2a所示,BSH-1和CCX中的AcXEs活性在6 h时达到最大值,随后逐渐降低,而芽孢杆菌也在6 h时大量富集(图3c),这表明,BSH-1中的O-乙酰基可能会被人结肠中的芽孢杆菌和拟杆菌消化利用。如图2b-d所示,BSH-1和CCX中阿拉伯呋喃糖酶活性在6 h时最高,随后逐渐降低至和BLK组同一水平。另外,BHS-1组中的木聚糖酶活性也随着发酵的进行逐渐增高,并在24 h时达到峰值,随后逐渐降低(图2c)。BSH-1和CCX中的木糖苷酶则是在发酵的前12 h内活性很低,但随后逐渐升高,并在48 h时达到最高值。


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图2 发酵过程中,各发酵系统中AcXEs、阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶的酶活性变化



体外发酵过程中游离单糖和寡糖的变化



本实验的初始发酵样本中,BLK组不含游离单糖与寡糖,BSH-1和CCX组中含有少量的游离单糖与寡糖;发酵12 h后,这两组样本中的阿拉伯糖,木糖,木二糖,木三糖,木四糖,木戊糖和木六糖含量都达到了最高水平,随后逐渐降低,这表明,BSH-1和CCX在发酵过程中会被酶逐渐水解。



体外发酵过程中微生物群落的变化



PCA分析结果显示(图3a),T24-BSH-1(T48-BSH-1)和T24-CCX(T48-CCX)的组间距离与T24-BLK(T48-BLK)不同,这表明,发酵24 h和48 h后,BSH-1和CCX组中的群落组成明显不同于BLK组。门水平上各样本中的结肠微生物细菌组成如图3b所示,所有样本中的微生物群落主要都包含厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌和放线菌。其中,BSH-1和CCX组中的拟杆菌与放线菌在发酵24 h后显著增加,而梭杆菌显著减少。基于相对丰度前50位属的热图(图3c)显示,相较于BLK组,BSH-1和CCX组中的多个属在发酵过程中发生了显著变化。另外,发酵24 h后,BSH-1中的拟杆菌与Prevotella_7显著增加,这表明,乙酰化木聚糖可能会被这两种菌利用。


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图3 (a)各样本微生物群落的PCA分析;(b)门水平上个样本中结肠微生物细菌组成柱状图;(c)基于相对丰度前50位属的热图



发酵过程中SCFAs的产量



如图4所示,在发酵阶段,BSH-1组中的乙酸、丙酸和正丁酸浓度显著高于BLK组,不过,相较于CCX组,虽然BSH-1组中的乙酰化水平较高,但产生的乙酸却并不比CCX组多,同时,BSH-1中的n-丁酸含量显著高于CCX组,这可能是由于乙酸在发酵过程中转化为了n-丁酸。另外,在发酵过程中所有分组中的戊酸浓度均一直很低。总的来说,发酵过程中,BSH-1和CCX组中的SCFAs均显著高于BLK组。


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图4 发酵过程中短链脂肪酸的浓度变化


总 结


本文利用体外培养发酵技术与高通量测序技术,研究了玉米穗轴木聚糖(CCX)和从竹子中获得的免疫刺激活性O-乙酰阿拉伯木聚糖(BSH-1),对结肠菌群构成的发酵环境以及人结肠菌群的影响,并得到以下结论:



①BSH-1能够通过抑制有害菌,促进有益菌生长,来调节人类结肠微生物群落的组成;


②BSH-1显著促进了乙酸、丙酸和n-丁酸等短链脂肪酸的产生;


③发酵48小时后,BSH-1中n-丁酸的浓度相较于对照组增加了2.41倍,同时也远高于CCX组;


④在发酵过程中,乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶的活性有所增强。‍



本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。


文章索引


Huang J, Wang Q, Xu Q, et al. In vitro fermentation of O‑acetyl‑arabinoxylan from bamboo shavings by human colonic microbiota[J]. International journal of biological macromolecules, 2019, 125: 27-34.